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荧光偏振法快速测定IgG和含Fc片段的蛋白质
[ 发布日期:2023-6-30 13:59:58    阅读次数:207 ]

简介

单克隆抗体在生物制药领域越来越受欢迎,在发现潜在有效的治疗性单抗的研发过程中,需要筛选大量的候选单抗。因此需要准确、快速和高通量的检测方法用于定量IgG和含Fc片段蛋白。现有的IgG/Fc片段定量方法包括:HPLC、表面干涉法、ELISA和TR-FRET,这些方法存在一些缺点,比如有的价格昂贵、有的耗费劳动力和时间。

Valita TITER方法为直接在细胞培养上清中检测和定量IgG和含Fc片段蛋白提供了一种非常精准且经济高效的解决方案。该方法采用荧光偏振技术检测IgG和Fc片段与G蛋白的相互作用,线性检测范围为2.5至100mg/L。分析在96孔板中进行,提供简单、高通量、快速且全自动化处理,样品量要求低,无需繁琐的制备过程。

在本应用指南中,我们介绍了在Spark®和Infnite® 200PRO多功能酶标仪上使用Valita TITER试剂盒定量检测IgG/Fc-蛋白的优化方案。

Spark多功能酶标仪是Tecan的一款高端仪器,可以提供多种配置。采用先进的模块化可升级设计,可以轻松地处理常规和复杂的检测。Spark独特的Fusion Optics是第一款将单色仪的灵活性与滤光片的灵敏度结合在同一台仪器内的解决方案。这种高度多功能性设计确保了实验研发和优化,即使在低信号范围内也可以实现荧光检测应用的高灵敏度。

Infinite PRO是一款操作方便的多功能酶标仪,最常用的检测模式如光吸收、荧光和化学发光,提供经济且高性能的检测。该平台一直致力于追求卓越,已经发展为一个经济实用的酶标仪家族,包含了六种以应用划分的配置。在Infinite 200 PRO上使用Valita TITER试剂盒,应选择Infinite F Plex配置。

实验原理

Valita TITER是一种快速、高通量的检测方法,它通过荧光偏振法(FP)对IgG-Fc与IgG结合肽的相互作用进行测定。


                      

荧光偏振法可以有效地分析分子大小的变化。当荧光标记分子受到平面偏振光激发,发射出相同偏振平面的光,则分子在整个激发态中保持静止。相反,如果分子在激发态中旋转并翻转出该偏振平面,会发射出与激发光不同平面的光。小分子在溶液中的翻滚速度比大分子快,因此可以使用光的去极化程度来测量与荧光团相关的分子大小的变化。

在本实验中,没有发生结合的带荧光标记的多肽与发生结合的IgG-多肽相比,转动更快并且去偏振更多(大五倍)。可通过计算偏振激发光源的平行面(偏振部分)和垂直面(去偏振部分)中发射的光强度之间的归一化差来计算,通常以毫偏振单位(mP)表示。

 

材料和方法

• ValitaTITER 试剂盒

• ValitaAPP 软件

• IgG 标准品(人血清)

• Spark 多功能酶标仪

• Infinite 200 PRO 多功能酶标仪(F Plex 配置)

 

 

实验步骤

根据使用说明书准备样品。按照Valita TITER 试剂盒说明绘制8点IgG标准曲线。简单地说,在Valita TITER微孔板的每个孔中加入60 l Valita Mab重组缓冲液以及60 l标准品。混匀避光孵育30分钟后,在Spark和Infnite 200 PRO酶标仪中,分别采用Spark Control™和i-control™预置的方案进行检测,参数设定详见表1。然后使用Valita APP 软件对导出的原始数据进行分析。

                         

G因子用来补偿光学组件对平行和垂直偏振光的不同响应。G因子计算是荧光偏振测量中一个重要的因素。虽然它可以手动设置,建议在开始样品测量之前对FP测试中使用的特定荧光基团执行一个G因子校准。

G因子与波长相关,方法中至少需要一个包含荧光基团的微孔(参照),和一个只包含缓冲溶液没有任何荧光基团的微孔(空白参照)。一旦为一个特定的荧光基团计算出G因子,这个值可以用于以后所有相同荧光基团的测量。

结果

在Spark和In‑nite 200 PRO酶标仪上使用ValitaTITER试剂盒定量检测得到8点标准曲线(从2.5到100mg/L),显示了多次测量间的低差异性。

                             

将Valita TITER法与被广泛认为是金标准的HPLC法的结果做比较(图4)。HPLC法和Valita TITER法的相关性显示这两种方法的精度类似,而Valita TITER法由于其同质性不需要复杂的样品制备,更加快速、高通量和操作简单。

                               

结论

实验表明Spark和In‑nite 200 PRO展出优秀的分析性能,提供了一个定量IgG和含Fc片段蛋白的高通量、易操作和低成本的解决方案。此外,该方法直接测定细胞培养上清液,不再需要复杂的样品制备步骤。



(文章来源:hmez.huimeihealth.com.cn/

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