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数字PCR仪在动防系统的应用
[ 发布日期:2023-10-10 8:54:12    阅读次数:449 ]
 一、数字PCR技术简述

数字PCR技术(digital polymerase chain reaction,dRCR)有别于实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)。dRCR是第三代PCR技术,无需标准曲线,即可对不同生物样本类型中获得的DNA/RNA进行更精确、更灵敏的绝对定量检测。

dRCR的原理及流程比较简单,以目前主流的纳米微孔芯片式dRCR仪为例:

1.配液:加入引物、探针、模板、Master Mix、水配制PCR反应体系

2.分区:将PCR反应体系加入纳米微孔芯片,芯片通常有20000个以上的纳米微孔,反应体系分配到各个纳米微孔之中,形成独立的反应单元;

3.扩增:随机分配的目标DNA/RNA分子在每个纳米微孔中进行单独、平行的PCR反应;

4.检测:扩增结束后检测各个纳米微孔的荧光信号;

5.计算:理论上,样本充分稀释时,每个纳米微孔包含少于或等于一个拷贝的目标DNA/RNA分子。但实际上,部分纳米微孔可能含有多个DNA/RNA分子,因此在计数阴性、阳性纳米微孔后,需要应用泊松分布进行校正,才能得到目标DNA/RNA分子的拷贝数或浓度。




图1 dRCR的实验流程



图2 dRCR的泊松分布校正


与第一、二代PCR技术相比,dRCR具有很多优势:一是特异性、灵敏性均有显著提高;二是在不依赖内参和标准曲线的前提下,可直接得到绝对量化指标;三是纳米微孔反应单元相互独立、封闭,避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰,极大的提高了检测的准确度和可重复性。

二、dRCR在动物疫病防控中的应用

1.核酸标准品定量

核酸标准品是一种已知浓度和纯度的核酸分子,可以用于核酸定量、质量控制和实验标准化等方面,是分子生物学和生物技术研究中非常重要的实验材料。使用分光光度法测量核酸标准品浓度,容易受到污染核酸或蛋白质和盐的影响,核酸标准品为质粒时,储备液的不均匀性或存在没有靶序列插入的质粒,同样影响标准品定量的准确性。

dPCR技术在核酸标准品定量方面的优势在于其高精度和高可靠性。dPCR技术可以准确地计算目标序列的拷贝数,避免了实时荧光定量PCR技术中的测量误差和扩增效率误差。因此,dPCR技术可以提供非常精确的核酸标准品定量结果。

2.动物疫病检测

dPCR技术在动物疫病检测方面的有广泛的应用前景,可以检测各种动物疫病的病原体,例如禽流感、口蹄疫、猪瘟等,其优势在于其高灵敏度、高特异性和高可靠性。dPCR技术可以检测样品中非常低浓度的病原核酸,灵敏度相对于qPCR通常高5-100倍,因此可以在早期发现病例,从而避免疾病的扩散和传播。

图3 qPCR梯度检测:10拷贝以下样本无法检出


图4 dPCR梯度检测:有效检出10拷贝以下样本


3.动物疫病多重检测

多重PCR技术一次扩增反应即可实现对多种病原体进行检测,相较单重检测而言成本显著降低。但是仍然存在许多影响多重PCR扩增与检测效果的因素,其中多个靶标扩增效率的一致性是最大的难题,检测重数越多,效率一致性往往越低。dRCR采用终点荧光检测和纳米微孔分区技术,检测结果不受扩增效率的影响,能准确定量和避免漏检。

目前主流品牌的dRCR仪均有多个检测通道,如罗氏诊断的Digital LightCycler数字PCR仪拥有6个检测通道,可实现6重病原检测。下图应用罗氏dRCR仪同时检测禽流感H5、H7、H9亚型和新城疫病毒4个病原,各检测通道间无干扰,定量结果准确性高。

图5 罗氏Digital LightCycler数字PCR仪多重检测

4.抗原快速诊断产品的评价

来源不同厂家的抗原快检试剂,灵敏度差异较大。dPCR可以绝对定量待测样品中的病原核酸,从而精准的评价抗原检测试剂的检测限。

5.动物疫苗研发中的应用

dPCR可对重组腺病毒疫苗等活载体疫苗进行定量,作为生产过程中质量评价、活性滴定、杂质评估的有力工具。同时,dPCR可定量动物血液中微量的病毒,可作为疫苗免疫效果评价的有效工具。

6.动物源性成分检测

世界各国每年都会有许多肉类掺假事件被曝光,包括将廉价肉掺入高价肉或添加非肉成分冒充肉及肉制品等。dPCR技术可直接对物种特异性DNA的拷贝数进行绝对定量,只需构建物种特异性DNA拷贝数与肉粉重量之间的关系曲线,即可对肉制品含量进行定量。

三、纳米微孔芯片数字PCR仪新贵

Digital LightCycler数字PCR仪是罗氏最新推出的高性能产品,充分拓展数字PCR的应用领域。

图6罗氏Digital LightCycler 数字PCR仪

罗氏Digital LightCycler亮点

1.应用灵活:阵列式纳米芯片技术,3种密度芯片可更换;

2.多重检测:6 重荧光多色检测,便于开发更多的应用;

3.高度自动化:分析系统整合PCR反应、芯片检测功能;

4.通量高单次检测 8-96个样本,适合科研及临床检测;

5.时间快:单块板1.5h, 八块板满载则 4h 内完成样品扩增、分析;

6.5x预混液: 更大的样品量输入;

四、结语

dPCR以明显的技术优势,已经广泛应用于核酸检测的方方面面。dRCR在病原微生物检测,肿瘤液态活检,遗传生殖检测,公共卫生检测,环境微生物检测,RNA表达检测,NGS文库定量,甲基化检测等领域都发挥着越发重要的作用。通过建立完善的dPCR检测流程,相信dPCR能让蓬勃发展的分子诊断如虎添翼。


 
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